傳統(tǒng)的實驗室生物學是一種小規(guī)模操作；組織培養(yǎng)器皿很少會大于實驗者的手掌，容量度量以“毫升”為單位，蛋白純化能夠產出幾微克就算大功告成。隨著人們越來越關注轉化研究、結構生物學和再生醫(yī)學，很多科學家開始從“大”處著眼。無論是試著純化幾克蛋白進行結晶實驗，還是測試全新基因產物發(fā)展成新藥的可行性，這些研究者很快就會發(fā)現(xiàn)自己開始思索復雜的大規(guī)模細胞培養(yǎng)。
 

    多虧了生物技術工業(yè)的成就，細胞培養(yǎng)的縱向擴展已經是一條康莊大道。“這個領域已經迸發(fā)出來，因為大量的產品層出不窮，在非常大的生物反應器中，藥物能夠在哺乳動物細胞中大批量的生產出來。”位于美國馬里蘭州貝塞斯達市的國家糖尿病、消化與腎病研究所生物技術核心實驗室主任 Joseph Shiloach 補充道，取決于細胞類型，必需的設備和試劑通常有現(xiàn)貨**。

    檢視懸浮培養(yǎng)

    對很多科學家來說，大批量的細胞生長最顯見的選擇是采用他們早已熟知的技術：懸浮培養(yǎng)。大量的細胞系已經能夠適應小旋轉瓶的生長環(huán)境，因此最初的規(guī)模擴大就只是買個更大的旋轉瓶。懸浮培養(yǎng)也為研究者進一步擴展提供了多種選擇。

    在搖瓶中進行培養(yǎng)尤為靈活，研究者可以通過在單個平臺上逐步擴大尺寸來加快速度。“你可以弄一個小尺寸的平臺（搖床）放在恒溫箱中，而且……可以從只有幾毫升培養(yǎng)物的試管開始，然后一直擴大到在大的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)數(shù)升的培養(yǎng)物。”位于加州卡爾斯巴德的生命技術公司細胞生物學高級產品經理 Henry Chiou 表示。

    必要時，適用于搖床或者旋轉瓶的懸浮培養(yǎng)法通常很容易擴展到更大的尺寸。“你可以嘗試不同類型的搖瓶和旋轉瓶去滿足最開始工作時所需的體積，而如果你需要再增加一點點體積，就可以采用小型的生物反應器。” Shiloach 說。

    生物制藥行業(yè)例行采用在生物反應器中的懸浮細胞培養(yǎng)來制造臨床獲準產品，因此供貨商制造出的系統(tǒng)規(guī)格從臺式到工業(yè)規(guī)模的都有。如今，這樣的生物反應器很多都使用了一次性的培養(yǎng)室以避免滅菌的困難。“整個生物反應器都是一次性的，所以購買時一切所需都已經裝配好了，你只需要加入培養(yǎng)基。” Shiloach 說。他接著說，“你可以在初期操作時使用小一點的發(fā)酵罐，非常類似于搖瓶，你可以將其拿進通風廚，你可以將其進行接種……，而后你可以把它放起來并連接到系統(tǒng)中。”

    一開始從小規(guī)模到大一些規(guī)模的旋轉瓶或搖瓶培養(yǎng)，甚至到小型生物反應器都看起來挺簡單的，但隨著規(guī)模增長，就會突然出現(xiàn)新的問題。大型生物反應器通常需要更復雜的硬件支撐，并需要為維持pH值和養(yǎng)分水平進行更細致而頻繁的測試，研究者可能需要額外的操作培訓。“一旦你開始規(guī)模擴大并需要特定的產量，這個產量就會特別依賴于細胞的健康程度。” Chiou 補充道，“仔細地監(jiān)控你的培養(yǎng)變得尤為重要。”

    一些供貨商提供了略微不同的旋轉瓶、懸浮培養(yǎng)瓶和生物反應器，通常是為解決具體問題做出的全新改動。舉例來說，位于紐約州華盛頓港的頗爾生命科學公司目前正在消瘦一種臺式的生物反應器，能夠攪動裝滿細胞和培養(yǎng)基的一次性塑料袋。這個袋子放置在一個特殊的搖床頂上，通過兩個單獨的軸線來回擺動。低剪切力與一次性培養(yǎng)室的結合有助于維持從一批細胞到下一批細胞的一致性。位于美國新澤西州皮斯卡塔韋市的通用電氣醫(yī)療集團生命科學部使用的方式類似于其WAVE生物反應器，這一反應器的特色也是在擺動的平臺上的一次性袋狀生長室，尺寸大小從 100 毫升到 500 升不等。

    鑒于各方面的選擇，科學家需要花些時間去考慮哪種方式是最有效的。特別是對于需要保持溶解氧和pH值等參數(shù)時， Shiloach 建議詢問支持設備并檢測每個系統(tǒng)之所需。如果一個系統(tǒng)看上去很適合， Shiloach 說，“我認為最好的方法是搞一臺試試。”

    寧“轉”勿戰(zhàn)

    當選擇的細胞無法在懸浮狀態(tài)下生長，一些研究者需要尋找其他方法來擴大規(guī)模，亦或不必如此。很多情況下，最明智的選擇還是轉向懸浮培養(yǎng)。“如果你有一個產物需要檢測，而且你只需要幾毫克來檢測它的生物活性是否是你想要的，你可以從貼壁（細胞）開始做起，但如果產物看起來不錯，我想最好還是試著改變這些細胞，或是試試另一個細胞系……然后就使用懸浮培養(yǎng)。” Shiloach 說。

    如果目標是臨床治療，那么轉變細胞系也可能會幫助加速監(jiān)管部門的審批過程。像中國倉鼠卵巢（CHO）和人類胚胎腎細胞 293（HEK-293）等已建立起來的懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)形成了目前生物制藥生產的支柱，因此監(jiān)管部門已經對此頗為習慣。

    轉向適應懸浮的細胞系是擴大蛋白產量的絕佳策略。“當我們出去跟許多人討論時，很少有人真正需要在蛋白表達中采用某個特定的細胞系。標準的體系往往就是那幾個， 293 和 CHO ,看起來適合絕大多數(shù)人的需求。” Chiou 說。

    為了迎合這些需求，一些公司提供一系列的 293 和 CHO 細胞株系，它們尤其適用于大規(guī)模的懸浮培養(yǎng)和蛋白產生。例如，生命技術公司的Expi 293 系統(tǒng)使用一種特殊的 293 細胞株和一種專有的培養(yǎng)基去獲得高水平的瞬時蛋白表達。該公司稱，Expi 293 每升所產生的蛋白比常規(guī)培養(yǎng)系統(tǒng)要高出 3 到 5 倍。產量升高意味著對大規(guī)模培養(yǎng)的需求減少。 Chiou 表示，“過去，如果有人覺得他們需要擴大到5升反應才能獲得足夠的蛋白，他們現(xiàn)在可以保持在 1 到 2 升的反應規(guī)模。”他接著說，“這大大地降低了規(guī)模需求所帶來的影響。”

    所需的培養(yǎng)規(guī)模即便只增加一點，也常常會帶來大量的成本和復雜性增加，因為規(guī)模擴大的問題往往是非線性的。培養(yǎng)規(guī)模從 1 升增長到 2 升可能只需要使用大一點的搖瓶，但是從 5 升到 6 升可能意味著購置臺式的生物反應器并需要學習如何使用它。“轉折點一般發(fā)生在你需要改變所使用的容器時。” Chiou 說。

    當 CHO 和 293 等標準的蛋白表達細胞系不起作用時（可能是需要這些細胞無法產生的特殊糖基化模式），一些研究人員轉而使用微載體。這種微型的塑料小球為貼壁細胞提供了結合的基質表面。一旦載入，這些微載體和附帶的細胞就能在搖瓶或旋轉瓶中懸浮。這項幾十年前的技術為很多不能采用其他培養(yǎng)方式的細胞提供了懸浮培養(yǎng)的諸多便利。微載體最適用于蛋白或病毒的產生，因為從微球上回收活細胞有時是很棘手的。通用電氣、西格瑪奧德里奇公司和英國阿克菲爾德的萊伯泰科公司等儀器**商均提供這種微載體。

    多者恒多

    對于某些細胞類型和項目而言，現(xiàn)行的懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)都是不可行的。干細胞尤其如此，很難進行懸浮培養(yǎng)，而疫苗生產的標準株系 Vero 細胞也需要緊密地貼在培養(yǎng)皿上。所幸，正在嘗試大批量培養(yǎng)這種緊密貼壁細胞的科學家可以從多個成熟的技術中進行選擇。

    最簡單的策略是使用內部具有多層平板的特殊培養(yǎng)瓶以提高每個培養(yǎng)瓶的基質表面積。這種平行板的方法比懸浮培養(yǎng)稍微麻煩一些，但是儀器制造商已經在努力的進行優(yōu)化。“我們作為首家公司，數(shù)十年前就與細胞工廠一起提出這一設計，而且我們在這個特定產品線上有豐富的選擇。”位于美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆的賽默飛世爾公司細胞培養(yǎng)技術應用專員 Cindy Neeley 表示。其他公司也提供了貼壁細胞的分層式生物反應器，也經常為特定用途進行優(yōu)化。例如，位于密蘇里州圣路易斯市的西格瑪奧德里奇公司的 CELLine 生物反應器就是專為擴大蛋白表達系統(tǒng)和單克隆抗體生產所設計的。

    將細胞從小的單層培養(yǎng)瓶轉到平行層容器也給它們自身帶來了一系列的挑戰(zhàn)。 Neeley 指出，即使多層培養(yǎng)瓶的所有分層一個緊挨著一個，但每層的情況也會有所不同。“只要超過 10 層，就會遇到層間營養(yǎng)物分配的問題，各層的氣體條件也是如此，這對我們而言是一大挑戰(zhàn)。” Neeley 說。因此，大的平行板系統(tǒng)經常配備著特殊的支持設備。

    在購買這種系統(tǒng)時，研究者也應該考慮他們的細胞目前更需要哪一種基質表面。某種細胞如果已經適應于貼壁生長在一種涂層的培養(yǎng)瓶中，當轉移到一個具有不同涂層的多層培養(yǎng)瓶時就可能會生長不良。對于已經建立的細胞系，為了確保涂層是相同的，最簡單的方式就是在同一個**小型培養(yǎng)瓶的廠商手中購買平行板系統(tǒng)。

    然而，這對于最前沿的再生醫(yī)學研究者來說是不起作用的。干細胞通常過于挑剔，以至于無法在市面上現(xiàn)成的通用基質表面上生長，它們需要特殊的涂層試劑，例如 BD 生物科學公司的 Matrigel 產品。在大型平行板培養(yǎng)瓶上使用這種試劑進行涂層不僅比較復雜，而且價格高昂。這使得平行板系統(tǒng)離干細胞的研究工作很遠，至少目前是這樣。“我們還沒能做到這一步，但是與我們同樣境地的公司應該向這一方向努力，找出……能夠使這些干細胞附著并生長的容器。” Neeley 說。

    但是對于能夠在平行板搖瓶中生長的細胞而言，隨后的規(guī)模擴大（直至工業(yè)化規(guī)模）相對比較簡單。事實上，賽默飛世爾公司最大版本的細胞工廠在疫苗生產工廠中已經司空見慣，工廠中的培養(yǎng)瓶非常大，以至于簡單地挪動位置都是最大的挑戰(zhàn)之一。

    操作多層的大平行板培養(yǎng)瓶存在一定的困難，因此其他設備研發(fā)者開始創(chuàng)制出更加小巧的系統(tǒng)。位于比利時布魯塞爾的 ATMI 公司生產的 xPansion 多層生物反應器使用更薄的平板，并且與賽默飛世爾的細胞工廠相比顯得更加緊湊。因此 xPansion 能將相當于20個細胞工廠的細胞打包到一個容器中。除了節(jié)省空間外，更緊湊的系統(tǒng)也減少了培養(yǎng)瓶的數(shù)量，這樣技術人員在更換培養(yǎng)基或收獲細胞時就不用每次處置大量的培養(yǎng)瓶。

    ATMI 公司類似于其他的培養(yǎng)瓶生產者，也在嘗試著給自己的平板做涂層，以使基質表面適用于更多外源的細胞類型。“今天我們只有一種涂層，但是我們實際上已經在（為干細胞）研究特殊的涂層。” ATMI 公司細胞培養(yǎng)技術部主任 Jose Castillo 說。

    順其自然

    研究人員在分泌蛋白的表達系統(tǒng)中使用貼壁細胞時，也應該考慮另一種規(guī)模擴大策略：固定床式生物反應器。在該進展中，細胞粘附在小的微球或纖維上，并包覆在一個大型容器中。介質通過基質持續(xù)循環(huán)，為固定床帶來新鮮的養(yǎng)分與氧氣，同時排出細胞廢料及分泌出的蛋白。一旦細胞被粘附，就很難甚至無法從固定床中恢復這些細胞，但是對于分泌蛋白產物來說，這點通常不是問題。

    固定床系統(tǒng)能夠將大量的貼壁細胞維持在相對較小的體積中。例如 iCells 500 系統(tǒng)能夠在僅為 25 升的體積中做到 500 平方米的貼壁細胞培養(yǎng)基質表面積（約為兩個網球場的面積）。在蛋白表達和病毒疫苗生產方面，較高的基質表面積與體積之比甚至讓固定床系統(tǒng)比懸浮培養(yǎng)更有優(yōu)勢。 Castillo 說，“你將能夠以這種方式優(yōu)化你的灌注過程，在與攪動池生物反應器的參考步驟相比時，（產物）實際上收集到了更小的體積中。 ”這一點確保 iCells 500 系統(tǒng)適用于實驗室和工業(yè)化應用。

    無論研究者想要擴展哪種細胞培養(yǎng)類型，由設備制造商帶來的最新技術進步已經讓規(guī)模擴張之路變得相當順暢。 Shiloach 解釋，就在過去的幾年間，“不僅培養(yǎng)基有所進步，細胞系也變好了，所有的分子生物學研究都具備更加有效的方式。對我來說，似乎困難在于找到適合的產品，而不是去制造產品。”